1. 紫外消毒30min后關閉紫外燈，開啟超凈臺正常工作狀態，用酒精消毒操作者的雙手。

2. 將所需的培養基，胰酶確保瓶身干凈后放于工作臺面內，點燃酒精燈，將培養基和胰酶瓶口用酒精棉球擦拭后，再將瓶口對準在酒精燈上消毒2-3次，旋開瓶蓋后再次分別消毒瓶口和瓶蓋，分別放于酒精燈的兩側。特別是將培養基瓶放于斜架上，瓶口對準酒精燈，且放在距離酒精燈近的位置，瓶蓋置于酒精燈的另一側。

3. 將培養瓶瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次，瓶蓋放于酒精燈右側后將培養瓶內的培養液懸空倒進污缸，在酒精燈消毒2-3次瓶口，豎直放好。取1ml移液器快速移動在酒精燈上消毒1-2次，然后再裝上槍頭吸取1.5ml胰酶液，懸空移入培養瓶內。

4.  將培養瓶平放使胰酶浸沒整個瓶壁的細胞層，計時約40s，立馬豎起對著燈光可觀察到細胞與細胞之間有針孔樣縫隙，并有1-2個細胞脫落，這時為胰酶消化的合適時機。若看到成片的細胞從瓶壁脫落為胰酶消化過度；若看不到針孔樣縫隙和細胞脫落，則需繼續消化，輕輕的迅速平放培養瓶使胰酶浸沒細胞層1s后迅速豎起對著燈光觀察細胞情況，可反復幾次，直至出現針孔樣縫隙和1-2個細胞脫落的好消化狀態。用移液器將胰酶吸凈。

5. 吸取1ml培養基于培養瓶內，并用移液器吸取少量的培養基輕柔的反復沖洗培養瓶壁5-8次，使貼壁細胞完全脫落于培養基內再輕輕吹打2-3次，使細胞盡可能處于單個懸浮狀態。

6. 取2或3個高壓后的新培養瓶，瓶口在酒精燈上消毒2-3次，旋開后分別再次消毒瓶口和瓶蓋2-3次分別放于酒精燈兩側，然后將細胞培養基均勻的分到3或4個培養瓶內（注意原來傳代時使用的培養瓶可繼續傳代使用），進行1傳3或1傳4的培養。

7. 拿出1支高壓后的5ml定量移液管，在酒精燈上灼燒尾部后裝于電動移液器上，再次放于酒精燈上灼燒整個定量移液管管身2-3次，懸空進入培養基瓶內吸取4ml培養基懸空移入每個培養瓶內，將培養瓶瓶口和瓶蓋在酒精燈上消毒2-3次后擰緊平放，在瓶身做好實驗標記。

8. 將培養基瓶口和瓶蓋消毒2-3次后擰緊，熄滅酒精燈，整理實驗臺面，取出實驗試劑及污缸等，關閉超凈工作臺。

9. 將培養瓶放于28℃,5%CO2的培養箱內培養，旋開瓶口少許。注意整個培養箱底托盤內一定要放高壓后的水，且定期更換確保無菌。

   每天定時觀察細胞生長情況，一般72-96h后，細胞生長密度大于90%，即可進行細胞的傳代或保株。