ELISPOT檢測的是陽性細胞的頻率，也就是出斑點的細胞占整個加入細胞的比例。不僅要計數斑點，也要計數孔中加入的細胞。每孔加入的細胞有一個上限，大約是60萬，這是96孔板每個孔能容納的細胞極限，超過這個極限，細胞就不再單層平鋪在孔底了。而ELISPOT檢測的前提條件是細胞單層平鋪在孔底。

理論上說，同一次實驗，孔內的斑點數量應該和加入孔中的細胞數量成正比，不論加入細胞多少，陽性細胞的頻率是恒定的。正是基于這一前提，ELISPOT檢測的單位被定義為，每百萬細胞中陽性細胞的數目，英文SFC/Million (Spots Forming Cells per Million cells)。

但是實際情況究竟怎樣呢，斑點數量真的和細胞數量成正比嗎？

經過反復的實踐，我們發現這條規律只有在特定的前提下才成立。這個前提就是有足夠的抗原呈遞細胞（APC）密度，以滿足細胞間的相互作用。由于特異性的ELISPOT反應都需要APC把抗原呈遞給T細胞，所以只有APC充足的時候，斑點數目才和細胞數目成正比。

通常的ELISPOT檢測是不單獨制備APC的，而是依靠混合在淋巴細胞中的APC擔負抗原呈遞的作用。好在PBMC和小鼠脾臟淋巴細胞都含有足夠的APC，在特定的細胞濃度下都會發揮正常的抗原呈遞功能。另外，不同的刺激物類型對APC的要求也不一樣，需要具體情況具體分析。

l 非特異性刺激物

非特異性的刺激物可以直接刺激淋巴細胞，這種刺激不依賴于APC或者其它輔助細胞，是單細胞反應行為。所以它對細胞密度沒有要求，在極寬的細胞濃度范圍之內——多至40萬/孔，低至5千/孔——斑點數量和細胞數量都有簡單的正比例關系，參見圖4.2。但是考慮到，只有恰當的斑點數目才便于數據統計，所以推薦細胞密度為10萬/孔。如果細胞數目過多，滿孔都會被斑點覆蓋，并且相互重疊。

l T細胞表為肽/CEF/ICE

T細胞表位肽比較特殊。一方面，它需要APC的呈遞，是雙細胞反應行為；另一方面它不需要APC的加工，對于APC的依賴相對較低。以使用ICE多肽庫為例，實踐中我們發現在5萬/孔—60萬/孔的細胞濃度范圍內，都可以獲得很好的斑點數與細胞數的線性關系（參見圖4.2）。通常我們推薦20萬/孔的細胞密度。如果在這樣的細胞密度下，斑點過多或者過少，可以根據實際情況，在線性范圍許可的限度內減少或者增加每孔種植的細胞密度。

l 普通多肽/蛋白/組織提取物

不論是普通多肽（比如重疊多肽庫）還是蛋白質或者蛋白類的組織提取物，這些刺激物都需要APC的攝取、內化、加工、呈遞，之后T細胞才能被刺激。所以，使用這些刺激物的時候，一定要保證足夠的細胞密度。根據我們的經驗，細胞密度要至少達到20萬-30萬每孔。多肽推薦的細胞密度為30萬/孔，蛋白推薦的細胞密度為40萬/孔。也可以根據實際情況，在線性范圍內調整，參見表4.1與圖4.2。